慢病毒感染細胞|為什么你的感染效率那么差?

來源: 上海吉凱基因化學技術有限公司   2019-10-29   訪問量:414評論(0)

慢病毒不但可感染分裂或非分裂細胞,還可將外源基因有效地整合到宿主染色體上,從而實現持久表達,又不易引發機體免疫反應,被譽為“細胞實驗佳選、體內實驗必備”的工具病毒。

并且慢病毒作為基因治療載體在各類遺傳性和后天性的人類疾病的治療中倍受歡迎:從基礎研究到臨床應用,高純度、高滴度的慢病毒都是基因操作的理想工具。

由于實驗中使用的細胞類型不同,慢病毒感染的效率也會有差異;要想提高慢病毒的感染效率,合適的實驗步驟和最佳的實驗條件是成功的關鍵!

以“24孔培養板、貼壁細胞”為例,慢病毒感染細胞的常規操作步驟是這樣的:

Day 0

接種細胞:

每孔按5×個待感染細胞鋪板,用含有 10% FBS的DMEM培養基培養;

Day 1

細胞感染:

感染前,根據說明書用完全培養基配置感染液,備用吸掉舊培養基,更換為感染液; 并參考細胞 MOI值,計算病毒使用量,加入病毒進行感染,混勻;

Day 2

病毒感染8-16h后,換回常規培養基,繼續培養;

Day 3-4

確認感染效果:

感染72h后,顯微鏡下觀察感染效果,如EGFP、Cherry的表達情況;

如果你以為所有的細胞操作都這么簡單的話,那真的是too young too simple!

那么在慢病毒感染細胞過程中,到底會遇到哪些問題呢?

在細胞感染時, MOI是一個非常重要的指標,如何確定MOI值呢?

MOI:復感染指數,是指病毒對細胞的感染能力,MOI越高,細胞越難被感染。通常把某株細胞有80%被感染時所用的病毒顆粒數和細胞數目的比值作為該株細胞的MOI。

MOI=(病毒滴度×病毒體積)/細胞數目

感染條件及MOI的選擇原則:

1. 在細胞形態不受影響的情況下盡可能用少的病毒感染細胞

2. 選擇感染效率80%左右的作為最佳感染條件

通過細胞感染預實驗可以知道慢病毒對細胞的最佳感染條件,來確定細胞的MOI,進行正式實驗。

由于不同實驗室細胞代數、狀態等因素,MOI值存在一定差異。吉凱基因已對常見細胞的MOI和感染條件進行了匯總,在吉凱基因公眾號后臺回復“MOI”即可查看!

如何解決細胞難感染的問題?

慢病毒對細胞的感染效率受多個因素影響,如細胞自身生長的狀態,細胞數量,細胞被慢病毒感染的難易程度等。因此保證細胞正常增殖,輪廓清晰,合適的細胞密度,選擇最優的感染條件可以更好的保證感染效率。

對于一些較難轉染的細胞,如原代細胞、干細胞、不分化的細胞等,可以通過添加病毒感染增強液來顯著提高轉染效率。

吉凱基因自主研發了HitransG A和HitransG P 2款感染增強液,可顯著提供難感染細胞的感染效率。詳細看一下這2款增強液的原理和適用范圍。


以下是使用吉凱基因包裝的慢病毒配合增強液HitransG在難感染細胞中的效果圖,是不是以后再也不擔心細胞難感染的問題。



此外,對于懸浮細胞,可采用離心感染方法,減少病毒感染時的體積,從而進一步提高感染效率。如將細胞培養板密封后,用平角轉子離心機1000g離心1h,再放回培養箱中正常培養。

除了難感染外,加入慢病毒后,細胞死亡也是科研的又一攔路虎。

加入慢病毒后,細胞死亡很厲害,該如何處理?

慢病毒中的雜質是造成細胞毒性的主要因素。

小編在這兒提醒大家:“一定根據自己的實驗需求,選擇合適純度的慢病毒!”

吉凱基因 專業病毒包裝17年,年產上萬次病毒產品;并且通過獨特的分級純化工藝,可提供A級、B級和C級3種不同純度級別的慢病毒產品,滿足不同實驗需求。

如果不幸,遇到了細胞死亡的情況!怎么辦?

吉凱給您來支招:

調整并降低感染的MOI值,并且在感染后4小時、8 小時、12 小時對細胞進行觀察;若發現細胞狀態變差時,則需要立刻對細胞進行換液操作,使用新鮮的完全培養液替換病毒感染培養液。

如果這些技能您都掌握了,那么恭喜您離Nature、Cell、Science又近了一步~~

我們一起來看看2018年那些用了吉凱基因慢病毒產品的科研大咖都發表了什么樣的文章吧!

【1】瑞金醫院高血壓研究所:A2A Receptor Activation Attenuates Hypertensive Cardiac Remodeling via Promoting Brown Adipose Tissue-Derived FGF21,Cell Metabolism(IF20.565)

吉凱產品:干擾慢病毒;

【2】北京安貞醫院:Cardiac Fibroblast-Specific Activating Transcription Factor 3 Protects Against Heart Failure by Suppressing MAP2K3-p38 Signaling,Circulation

(IF 18.881)

吉凱產品:干擾慢病毒、過表達腺病毒等;

【3】南方醫科大學: Long noncoding RNA lnc-TSI inhibits renal fibrogenesis by negatively regulating the TGF-β/Smad3 pathway, SCIENCE TRANSLATIONAL MEDICINE (IF 16.71)

吉凱產品:CRISPR-Cas9敲除慢病毒

【4】山東大學附屬省立醫院:Blocking FSH inhibits hepatic cholesterol biosynthesis and reduces serum cholesterol,Cell Research (IF 15.393)

吉凱產品:干擾慢病毒、過表達腺病毒等;

【5】重慶醫科大學第二附屬醫院:CD36 palmitoylation disrupts free fatty acid metabolism and promotes tissue inflammation in non-alcoholic steatohepatitis,Journal of hepatology(IF 15.04)

吉凱產品:慢病毒;

【6】浙江大學醫學院附屬第二醫院:EphrinB2 Regulates Cardiac Fibrosis Through Modulating the Interaction of Stat3 and TGF-β/Smad3 Signaling,Circulation Research (IF 15.211)

吉凱產品:干擾慢病毒;

【7】中國科學院神經科學研究所:PDGFRβ cells rapidly relay inflammatory signal from the circulatory system to neurons via chemokine CCL2,Neuron(IF 14.319)

吉凱產品:干擾慢病毒;

【8】海軍軍醫大學東方肝膽外科醫院:Distinct Role of Nuclear Receptor Corepressor 1 Regulated de novo Fatty Acids Synthesis in Liver Regeneration and Hepatocarcinogenesis,Hepatology (IF 14.079)

吉凱產品:干擾慢病毒;

【9】南京大學:Regularizing firing patterns of rat subthalamic neurons ameliorates parkinsonian motor deficits,The Journal of Clinical Investigation (IF 13.251)

吉凱產品:干擾慢病毒;

【10】中山大學附屬第一醫院:Long noncoding RNA LERFS negatively regulates rheumatoid synovial aggression and proliferation ,The Journal of Clinical Investigation (IF 13.251)

吉凱產品:過表達慢病毒;

【11】香港中文大學:A newly identified lncRNA MAR1 acts as a miR‐487b sponge to promote skeletal muscle differentiation and regeneration,Journal of cachexia, sarcopenia and muscle (IF 12.511)

吉凱產品:干擾慢病毒;

【12】首都醫科大學:Mandible exosomal ssc-mir-133b regulates tooth development in miniature swine via endogenous apoptosis,Bone research(IF 12.354)

吉凱產品:上調和下調慢病毒

【13】海軍軍醫大學東方肝膽外科醫院:Tumor-derived exosomal miR-1247-3p induces cancer-associated fibroblast activation to foster lung metastasis of liver cancer,Nature Communications(IF 12.353)

吉凱產品:慢病毒

【14】溫州醫科大學藥學院: Maresin 1 improves the Treg/Th17 imbalance in rheumatoid arthritis through miR-21, Annals of the rheumatic diseases (IF 12.35)

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【15】廈門大學:RPS23RG1 Is Required for Synaptic Integrity and Rescues Alzheimer's Disease–Associated Cognitive Deficits,Biological Psychiatry(IF 11.984)

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【16】南京大學:Orexin prevents depressive-like behavior by promoting stress resilience,Molecular Psychiatry(IF 11.640)

吉凱產品:干擾慢病毒;



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