蛋白結構研究分析

來源: 上海翊圣生物科技有限公司   2019-12-9   訪問量:1503評論(0)

蛋白結構研究分析

一、研究背景

上個世紀初,科學家們認為蛋白質是生命體的遺傳物質,而具有獨特的作用。隨著這個理論被證偽,真正的遺傳物質DNA的結構被給予了很大關注。然而,蛋白質作為生命體的重要大分子,其重要性也從未被忽視,而且在1950年代開始,科學家一直在探尋DNA序列和蛋白質序列的相關性。與此同時,蛋白質測序和結構解析蛋白質結構的努力開始慢慢獲得回報。更多的生化研究揭示了蛋白質的功能重要性,因此蛋白質的三維結構的解析對于深入理解蛋白質功能和生理現象起著決定性作用

圖1:蛋白三維結構圖

二、蛋白結構研究的發展

時間

科學家

事件

1958年

John Kendrew和Max Perutz

X射線衍射得到的高分辨率的肌紅蛋白Myoglobin的三維結構,然后是更加復雜的血紅蛋白Hemoglobin

1964年

Aaron Klug

提出了一種基于X射線衍射原理發展而來的全新的方法電子晶體學顯微鏡(crystallographic electron microscopy ),可以解析更大蛋白質或者蛋白質核酸復合體結構

1969年

Benno P. Schoenborn

提出可以用中子散射和原子核散射來確定大分子中固定位置的氫原子坐標。

1976年

Robert Langride

將X-ray衍射數據可視化,并在加州大學圣地亞哥分校成立了一個計算機圖形實驗室

1985年

John Deisenhofer等

德國科學家解析出了細菌光合反應中心,因此他們共享了1988年的諾貝爾化學獎。

2001年

Roger Kornberg

描述了第一個高精度的RNA聚合酶三維結構,正因此五年后他們共享了諾貝爾化學獎。

2007年,首個G蛋白偶聯受體結構的解析更是對藥物研究帶了新的希望。近些年來,越來越多的大的蛋白質結構得到解析。Cryo-EM超低溫電子顯微鏡成像用于超大蛋白質結構成像的研究日益成熟,并開始廣泛用于蛋白質結構的解析

三、蛋白結構研究的意義

示例1:來自阿貢國家實驗室等處的研究者利用高特異性的X射線晶體學技術解析了低氧誘導性因子(HIFs)的蛋白結構,低氧誘導性因子是腫瘤對低氧反應的重要調節子,該研究或為尋找新型藥物切斷癌細胞的氧氣和營養供給最終治療癌癥提供新的思路

示例2A型流感病毒(Influenza A virus,IAV)屬于正黏病毒科,是一個有囊膜的、分節段的單股負鏈的RNA病毒,不同亞型流感病毒與受體的結合主要是靠HA蛋白實現的,HA與受體的結合具有種屬特異性。在H7N9亞型流感病毒HA在演化過程中,它首先由禽特異性結合的G186Q226變成雙受體結合特性的V186Q226,最后演變成V186L226,這些研究有利于深入理解H7亞型禽流感病毒跨種傳播的分子機制,對于流感病毒疫情的預防與控制具有重要指導作用。

圖2:H7N9 HA受體結合特性演化模式圖

示例3非洲豬瘟是一個世界難題,有近百年的流行歷史,由于沒有疫苗和其他治療手段,撲殺豬是眼下控制疫情最有效的方法。2019年,研究團隊采用單顆粒三維重構的方法首次解析了非洲豬瘟病毒全顆粒的三維結構,闡明了非洲豬瘟病毒獨有的5層(外膜、衣殼、雙層內膜、核心殼層和基因組)結構特征,有這個理論的指導,可以幫助我們未來設計更安全、更有效的疫苗,從全球范圍來講,理論的意義是非常大的。

圖3:非洲豬瘟的全顆粒結構

四、蛋白質結構解析的研究過程和實驗方法

蛋白結構分析包含一系列產品的選擇用于免疫印跡蛋白電泳蛋白定量蛋白色譜質譜

 

圖4:蛋白結構研究過程

 

蛋白質結構解析的方法主要是兩種,x射線衍射和NMR。

1、單晶培養技術及結構分析技術

1)蛋白質結晶方法

 

2)結構分析技術

(1)x射線衍射

x射線衍射是將表達蛋白的基因PCR之后克隆到一種表達載體中,然后在大腸桿菌中誘導表達,提純之后摸索結晶條件,等拿到晶體之后,工作便完成的80%,將晶體進行x射線衍射,收集衍射圖譜,通過一系列的計算,很快就能得到蛋白質的原子結構。

圖5:x射線衍射原理

(2)NMR

首先通過基因工程的方法,表達出目的蛋白,提純之后,摸索一下蛋白穩定的條件,如果蛋白沒有聚合,而且折疊良好,便將蛋白樣品(通常是1mM~3mM,500ul,pH6~7的PBS)裝入核磁管中,放入核磁譜儀中,然后用一系列寫好的程序控制譜儀,發出一系列的電磁波,激發蛋白中的H、N13、C13原子,等電磁波發射完畢,在收集受激發的原子所放出的“能量”,其實也是小磁場,通過收集數據、譜圖處理、電腦計算從而得到蛋白的原子結構。

圖6:血紅蛋白結構建模

x射線與NMR技術特點

優點

缺點

x射線衍射

速度快:通常只要拿到晶體,甚至當天就能得到結構

不受大小限制:無論是多大的蛋白,或者復合體,無論是蛋白質還是RNA、DNA,還是結合了什么小分子

射線方法解析蛋白的瓶頸是摸索蛋白結晶的條件,

NMR

蛋白在液體中得到結構,是一個動態的結構,因為是動態就很容易的研究蛋白與其他蛋白或者配基的相互作用。

受大小的限制(上限是50kd。)

蛋白表達量要大,一定要在胞質中表達

蛋白要折疊。

(3)Cryo-EM超低溫電子顯微鏡成像

近些年來,Cryo-EM被用來解析很多結構非常大(無法用X-ray解析)的蛋白質(或者蛋白質復合體),取得了非常好的結果。同時,單電子捕捉技術取代之前的光電轉換成像的CCD攝像設備,減少了圖像中的噪音和信號衰減,同時并增強了信號。計算機成像技術的成熟和進步,也賦予了Cryo-EM更多的進步空間。然而,Cyro-EM與X-ray不同,該方法不需要蛋白質成為晶體,相同的是都需要低溫環境來減少粒子束對樣品的損害。

圖7:KIF1A殘基和微管蛋白之間的相互作用。

 

五、蛋白結構相關產品信息

1、反轉錄

反轉錄是以RNA為模板,通過反轉錄酶,合成DNA的過程。是DNA生物合成的一種特殊方式。反轉錄是進行基因工程過程中,以RNA為模板提取出DNA遺傳信息的過程

分類

產品名稱

貨號

規格

價格(

單酶

HifairTM II Reverse Transcriptase

11110ES92/93

1/5×10KU

626/2456

高靈敏度單酶

HifairTM III Reverse Transcriptase

11111ES92/93

1/5×10KU

1426/4626

Kit

HifairTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit

11119ES60

100T

755

高靈敏度Kit

HifairTM III 1st Strand cDNA Synthesis Kit

11135ES70

200T

1836

Kit(含gDNA去除步驟)

HifairTM III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)

11139ES70

200T

2196

預混液

HifairTM II 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR

11120ES60

100T

855

高靈敏度預混液

HifairTM III 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR

11137ES70

200T

2126

2、PCR試劑

聚合酶鏈式反應(PCR)是一種用于放大擴增特定的DN**段的分子生物學技術,它可看作是生物體外的特殊DNA復制,PCR的最大特點是能將微量的DNA大幅增加。

相關產品

分類

產品名稱

貨號

規格

價格(

PCR

HieffTM Taq DNA Polymerase

10101ES80/90

1/5 KU

155/735

HieffTM Robust PCR Master Mix(With Dye)

10106ES08

5mL

265

高保真PCR

Hieff Canace® High-Fidelity DNA Polymerase 高保真DNA聚合酶

10135ES60/76/80

100/500/1000U

626/2356/4256

Hieff Canace® Gold High-Fidelity DNA Polymerase 高保真DNA聚合酶

10148ES60/76/80

100/500/1000U

683/2383/4256

2×Hieff Canace® Gold PCR Master Mix高保真酶預混液

10149ES03/08

1/5mL

553/1453

熱啟動型PCR

HieffTM HotStart Taq DNA Polymerase (配體法熱啟動DNA聚合酶)

10110ES72/80

1/4×250U

186 /636

多重PCR

2× Hieff CanaceTM PCR Master Mix 高保真酶預混液 (for multiplex PCR)

10138ES03/08

1/5mL

625/2355

組織直擴PCR

Animal Tissue Direct PCR Kit 動物組織直接PCR試劑盒

10180ES50/70

50/200T

326/755

Mouse Tissue Direct PCR Kit (With Dye)

10185ES50/70

50/200T

323/982

3、分子克隆

在分子水平上提供一種純化和擴增特定DN**段的方法。常含有目的基因,用體外重組方法將它們插入克隆載體,形成重組克隆載體,通過轉化與轉導的方式,引入適合的寄主體內得到復制與擴增,然后再從篩選的寄主細胞內分離提純所需的克隆載體,可以得到插入DNA的許多拷貝,從而獲得目的基因的擴增。

分類

產品名稱

貨號

規格

價格(

單個片段連接

Hieff CloneTM Plus One Step Cloning Kit 一步法快速克隆試劑盒HOT

10911ES25/62

25T/5×25T

655/2455

1-5個片段連接

Hieff CloneTM Plus Multi One Step Cloning Kit 多片段一步法快速克隆試劑盒HOT

10912ES10/50

10T/5×10T

457/1967

替代TA連接克隆

Hieff CloneTM Zero TOPO-TA Cloning Kit 零背景TOPO-TA克隆試劑盒HOT

10907ES20

20T

625

Hieff CloneTM Zero TOPO-TA Simple Cloning Kit, MCS-Depleted

零背景TOPO-TA克隆試劑盒(不含MCS多克隆酶切位點)

10908ES20

20T

625

替代平末端連接克隆

Hieff CloneTM Zero TOPO-Blunt Cloning Kit 零背景TOPO-Blunt平末端克隆試劑盒HOT

10909ES20

20T

625

Hieff CloneTM Zero TOPO-Blunt Simple Cloning Kit

零背景TOPO-Blunt平末端克隆試劑盒(不含MCS多克隆酶切位點)

10910ES20

20T

625

4、抗生素

抗生素,是指由微生物(包括細菌、真菌、放線菌屬)或高等動植物在生活過程中所產生的具有抗病原體或其他活性的一類次級代謝產物,能干擾其他生活細胞發育功能的化學物質。

分類

產品名稱

貨號

規格

價格(

克隆篩選用抗生素

Carbenicillin, Disodium Salt 羧芐青霉素鈉

60202ES08/25/60

5/ 25/100g

358/1428/4628

Ampicillin, Sodium Salt 氨芐青霉素鈉

60203ES10/60

10/100g

108/968

5、蛋白濃度測定及SDS-PAGE膠

分類

產品名稱

貨號

規格

價格(

蛋白提取

RIPA Lysis Buffer (Strong) RIPA裂解液(強)

20101ES60

100ml

228

蛋白濃度測定

BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型)

20201ES76/86/90

500T/2500T/5000T

288/818/1518

Bradford蛋白濃度測定試劑盒

20202ES76/86

500T/2500T

98/398

Marker

GoldBand 3-color Regular Range Protein Marker(10-180 kDa)三色預染蛋白質分子量標準

20351ES76/90

2×250/10×250 μL

585/1985

GoldBand 3-color Regular Range Protein Marker(10-245 kDa)三色預染蛋白質分子量標準

20352ES76/90

2×250/10×250μL

615/2315

預制膠

Precast Protein Improve Gels, 10 wells 高分辨率梯度預制膠,10孔

36231ES10

4%-20%,1盒(10塊)

378

Precast Protein Improve Gels, 10 wells 高分辨率固定濃度預制膠,10孔

36233ES10

10%,1盒(10塊)

378

 

6、蛋白純化

蛋白純化是生命科學研究 領域中一項重要操作技術,其廣泛應用于蛋白功能、結構和相互作用的研究。翊圣生物提供全線蛋白純化產品,包括純化樹脂、預裝柱和層析空柱等,可高效、便捷分離純化目的蛋白,為下游應用提供良好保證,更大范圍滿足您的實驗需求

分類

產品名稱

貨號

規格

價格(

Flag親和純化凝膠

Anti-DYKDDDDK (Flag) Affinity Gel(Anti-Flag親和純化凝膠

20585ES03/08/25/60

1/5/25/100 mL

1936/6236/27286/96756

His標簽蛋白瓊脂糖純化樹脂

HisSep Ni-NTA Agarose Resin (His標簽蛋白瓊脂糖純化樹脂)

20502ES10/50/60

10/50/100 mL

678/2848/5328

HisSep Ni-NTA Superflow Resin (His標簽蛋白瓊脂糖高速純化樹脂)

20503ES10/50/60

10/50/100 mL

798/3358/5838

HisSep Ni-NTA 6FF Spin Column, 5ML(His標簽蛋白純化預裝柱)

20504ES08/25

5/5×5 mL

728/2938

HisSep Ni-NTA 6FF Spin Column, 1ML(His標簽蛋白純化預裝柱)

20505ES03/08

1/5×1 mL

298/1048

Imidazole咪唑

20501ES60/76

100/500 g

223/553

GST標簽蛋白瓊脂糖純化樹脂

GSTSep Glutathione Agarose Resin 谷胱甘肽瓊脂糖樹脂

20507ES10/50/60

10/50/100 mL

928/3848/6898

GSTSep Glutathione Superflow Resin 谷胱甘肽高速純化樹脂

20508ES10/50/60

10/50/100 mL

1238/4568/7928

GSTSep Glutathione 4FF Spin Column, 1ML(GST標簽蛋白純化預裝柱)

20509ES03/08

1/5×1 mL

328/1348

GSTSep Glutathione 4FF Spin Column, 5ML(GST標簽蛋白純化預裝柱)

20510ES08/25

5/5×5 mL

938/3928

Glutathione,Reduced (GSH) 還原型谷胱甘肽(GSH)

60342ES10/60/80

10/100/1000 g

209/1156/4596

核酸酶

Benzonase Nuclease (Endotoxin-free) 全能核酸酶無內毒素

20125ES25/50/60

25/50/100 KU

1125/1965/3245

Benzonase Nuclease 全能核酸酶

20156ES25/50/60

25/50/100 KU

418/768/1398

六、其他產品

分類

產品名稱

貨號

規格

價格(

普通PCR

HieffTM PCR Master Mix (With Dye)

10102ES08

5mL

150

HieffTM Robust PCR Master Mix(With Dye)

10106ES08

5mL

265

HieffTM HotStart PCR Genotyping Master Mix(With Dye)

10108ES08

5mL

345

高保真PCR

Hieff Canace® Gold High-Fidelity DNA Polymerase 高保真DNA聚合酶

10148ES60/76/80

100/500/1000U

683/2383/4256

2×Hieff Canace® Gold PCR Master Mix高保真酶預混液

10149ES03/08

1/5mL

553/1453

熱啟動型PCR

UNICON™ HotStart Taq DNA Polymerase (抗體法熱啟動Taq酶)

10113ES60/76/88

100U/500U/3000U

216/656/3665

2×UNICONTM HotStart PCR Master Mix (With Dye)

10111ES03/08

5mL

432

2×UNICONTM HotStart PCR Master Mix(No dye)

10112ES03/08

5mL

432

多重PCR

HieffTM Multiplex PCR Kit(Mg2+ free)

13278ES50/76

100/500T

875/3165

HieffTM Multiplex PCR Kit

13279ES50/76

100/500T

875/3165

HieffTM Multiplex PCR Master Mix

13280ES50/76

50/200T

875/3165

5× Hieff CanaceTM PCR Master Mix 高保真酶預混液 (for multiplex PCR)

10137ES03/08

1/5mL

1215/3065

組織直擴PCR

Mouse Tissue Direct PCR Kit 小鼠組織直接PCR試劑盒

10181ES50/70

50T/200T

326/755

Animal Blood Direct PCR Kit 全血直接PCR試劑盒

10182ES50/70

50T/200T

326/755

Plant Tissue PCR Kit 植物組織直接PCR試劑盒

10183ES50/70

50T/200T

326/755

其他克隆相關產品

T4 DNA Ligase T4 DNA 連接酶HOT

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Taq DNA Ligase Taq DNA 連接酶HOT

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1/2/10KU

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11802ES80/92

10/100×100μL

166/1236

X-Gal 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷

10901ES03/08

1/5g

426/1746

X-α-Gal 5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-吡喃半乳糖苷

10903ES25/60/72/76

25/100/250/500mg

399/769/1259/1979

蛋白標簽切割酶

Enterokinase, Recombinant, Expressed in E. coli 大腸桿菌表達重組腸激酶(不帶標簽)

20401ES60/70/76

100/200/500 U

425/645/1245

Bovine Thrombin, High Specific Activity, >2000 IU/mg 牛凝血酶(高活力,>2000 IU/mg)

20402ES03/05

1/2 KU

536/956

rTEV Protease 重組煙草蝕紋病毒蛋白酶

20403ES80/92/10/50

1/10/10×1/50 KU

986/6756/7856/27556

HB191204

 



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